Studied by 37 peoplePagrindinės pirminių transkriptų modifikacijos:
• šalinami RNR fragmentai;
• prijungiamos RNR sekos, kurių nėra pirminiuose transkriptuose;
• modifikuojami RNR nukleotidai (kovalentinės modifikacijos);
• vyksta redagavimo (nukleotidų keitimo) įvykiai.
Subrendusios tRNR molekulės turi būti struktūriškai panašios:
taip užtikrinama, kad su jomis galėtų sąveikauti transliacijos elongacijos veiksniai ir kad jos visos “tiktų” ribosomos A srityje;
tRNR turi būti ir skirtingos:
nes jas turi atpažinti skirtingos aminoacil-tRNR sintetazės.
Dirbant su RNR yra reikalinga:
ypatinga švara!
Nespecifinė endonukleazė
pirmenybę teikianti viengrandžių sekų, A / U turinčių, skaidymui
RNazė III
pirmoji identifikuota dvigrandė endoribonukleazė;
RNazė P atrasta
1972 metais Sidney Altmano;
RNazė P yra visų organizmų ląstelėse, kuriose vyksta
tRNR sintezė: bakterijose, archėjose, eukariotų branduolyje, eukariotų mitochondrijose ir chloroplastuose.
RNazė P yra ribonukleoproteinas, kurio RNR komponentas pasižymi
kataliziniu aktyvumu.
RNazė T atsakinga už:
3‘ galinių adenozinmonofosfatų pašalinimą nuo tRNR CCA sekoje
RNazėP skelia lyderinę seką:
pre-tRNR 5’- gale
RNazėP yra
ribonukleoproteinas,
Pre-tRNR brendimas. 5’-galo skėlimas-
RNazė P
Pre-tRNR brendimas. 3’-galo skėlimas ir ardymas-
endonukleazės ir egzonukleazės
Pre-tRNR brendimas. Nukleotidų kovalentinės modifikacijos-
atlieka įvairūs fermentai
Pre-tRNR brendimas. Introno (ų) iškirpimas ir likusių dalių (egzonų) sujungimas-
(įvairūs fermentai
Pre-tRNR brendimas prokariotuose. Bakterijose pre-tRNR transkriptai dažniausiai yra-
policistroniniai ir turi daugiau nei vieną individualią tRNR
Pre-tRNR brendimas prokariotuose.5’-galinę – lyderinę seką – atpažįsta ir skelia ribozimas –
RNazė P (endoribonukleazės aktyvumas)
Pre-tRNR brendimas prokariotuose. Individualias tRNR iš pirminio transkripto skelia kitos endoribonukleazės, o 3’-galą trumpina
egzoribonukleazės
Pre-tRNR brendimas prokariotuose. 3‘-galas – priekabos seka –
gali būti ir skeliama (jeigu nėra CCA) vienu endonukleolitiniu skėlimu – RNazė Z
Pre-tRNR brendimas prokariotuose. 5’CCA-3’ galą (daugeliu atveju tRNR genai tokios sekos nekoduoja) jungia-
tRNR nukleotidiltransferazė
Endonukleolitinis 3’-galo brendimo kelias:
skėlimas vyskta už nt diskriminatoriaus su RNaze Z;
Diskriminatorius –
– paskutinis pretRNR nt prieš jungiant CCA seką.
5’-CCA-3’ seka tRNR molekulių 3’-gale yra esminė
tRNR aminoacilinimui
CCA jungiantis fermentas –
tRNR nukleotidiltransferazė – jungia CCA prie pre-tRNR 3‘- galo;
Pre-tRNR brendimas eukariotuose.
• 5’ lyderinės (angl. leader) sekos pašalinimas (RNazė P);
• 3’ priekabos (angl. trailer) sekos pašalinimas (endonukleazės ir egzonukleazės, RNazė Z);
• 5’-CCA-3’ jungimas 3’-gale (tRNR nukleotidiltransferazės);
• Kovalentinės modifikacijos (įvairūs fermentai);
• Intronų pašalinimas kai kuriose tRNR (fermentų kompleksas).
Intronų iškirpimas ir egzonų sujungimas (splaisingas)
sudėtinė RNR brendimo dalis
Intronai iš pre-iRNR iškerpami dalyvaujant molekulinei mašinai –
splaisosomai.
Splaisingas:
• Intronas;
• Egzonas.
• 5’ splaisingo sritis;
• 3’ splaisingo sritis.
Intronai iš pre-tRNR iškerpami savitu keliu, dalyvaujant
fermentų kompleksui
Dalimis koduojamų tRNR gali koduoti ir intronų dalis, kurie pašalinami:
trans splaisingo būdu
Būdingos visų organizmų pre-tRNR brendimui:
• žinoma ~100 skirtingų modifikacijų;
• vyksta branduolyje, citozolyje, organelėse;
16S ir 23S rRNR iš transkripto skelia RNazė III
iš abiejų stiebo pavidalo struktūros pusių;
Kovalentinių modifikacijų taikinių nustatyme dalyvauja mažos branduolėlio RNR –
snoRNR (angl. small nucleolar RNA).
Aukštesniųjų eukariotų rRNR yra:
~ 110 2’-O-metilintų ribozių;
~ 95 pseudouridinai (Ψ- psi);
snoRNR, mažos branduolėlio RNR:
• Dalyvauja rRNR modifikacijų taikinių nustatyme;
• 70–300 nt ilgio RNR molekulės;
• Sintetinamos nukleoplazmoje;
• Modifikacijos vieta nustatoma komplementarumo principu;
• Nuo 1000 iki 10 000 kopijų branduolyje.
snoRNR nt sekos suskirstytos į dvi grupes:
– C/D dėžutę, kuri dalyvauja nustatant taikiniui 2’ O ribozės metilinimui rRNR molekulę:
• C dėžutės konservatyvi seka – RUGAUGA/U;
• D dėžutės konservatyvi seka – CUGA.
– H/ACA dėžutė, kuri padeda nustatyti uridino nt, kurie verčiami į pseudouridiną:
• H dėžutės seka – ANANNA;
• ACA sritis – nutolusi per 3 ribonukleotidus nuo snoRNR 3’ galo.
snoRNR, mažos branduolėlio RNR:
• Funkcionuoja kartu su savitaisias baltymais kaip snoRNP kompleksai;
• Prie kiekvienos prisijungę bent 4 baltymai, vienas jų ir turi modifikuojantį aktyvumą;
• Pvz.: žmogaus fibrilarinas (pagrindinis branduolėlio baltymas) yra 2’-O-metiltransferazė, o diskerinas – pseudouridino sintazė.
rRNR molekulėje buvo atrastas pirmasis
savaime išsikerpantis (angl. selfsplicing) intronas ir taip išaiškintas dar vienas splaisingo tipas
rRNR pirmtako genas turi
413 bp introną (intervening sequence, IVS);
Nustatyti trys skirtingi splaisingo mechanizmai:
– I grupės intronų iškirpimas;
– II grupės intronų iškirpimas;
– Slpaisosoma.
I ir II grupės intronų splaisingas yra vadinamas
autosplaisingu
T. Cech ištirtas pre-rRNR intronas pasižymi:
savita erdvine struktūra;
Išsikerpa savaime, taigi, yra ribozimas;
Priklauso vadinamajai I-ai savaime išsikerpančių intronų grupei;
I-os grupės savaime išsikerpantys intronai randami:
Vienaląsčių eukariotų branduolio rRNR;
Žemesniųjų eukariotų mitochondrijų / chloroplastų iRNR, tRNR, rRNR;
I-os grupės savaime išsikerpantys intronai. Išsikirpimo mechanizmas:
Dvi trans esterinimo reakcijos, fosfoesterinių ryšių skaičius lieka nepakitęs;
Reakcija grįžtama, bet in vivo kofaktoriaus perteklius stumia ją į produkto susidarymo pusę;
I-os grupės savaime išsikerpantys intronai. Reakcijai vykti būtinai reikia:
• pre-rRNR;
• Mg2+ jonų;
• kofaktoriaus – guanozino (nukleofilas).
Kofaktorius turi turėti
3’-OH grupę ir guanino bazę
I-os grupės savaime išsikerpantys intronai. Kur prijungiamas guanozino kofaktorius?
Guanozino kofaktorius prijungiamas introno guanozino kišenėje ir tiksliai išdėstomas pirmai trans esterinimo reakcijai;
I-os grupės savaime išsikerpantys intronai. Kuom svarbūs Me2+ jonai?
Me2+ jonai (Mg2+) svarbūs erdvinei struktūrai ir dalyvauja katalizėje
Kas nedalyvauja II-os grupės savaiminiam išsikirpime?
Nedalyvauja kofaktorius
Nukleofilas tai-
– introne esančios adenino nukleotido 2’-OH grupė
Po pirmos trans esterinimo reakcijos susidaro tarpinė kilpos pavidalo struktūra –
lasas (angl. lasso) su papildomu 2’-5’ fosfodiesteriniu ryšiu;
Kelintais metais atrasti intronai?
1977 m. tiriant adenoviruso iRNR (F. Sharp ir R. Roberts)
Eukariotų iRNR 5‘-galas. Kepurė tai-
struktūra eukariotų RNR polimerazės II transkriptuose;
Yra žinoma įvairių kepurės struktūrų.
Labiausiai paplitusi: eukariotų iRNR –
m7G;
Trifosfatazė –
pašalina fosfatą, hidrolizuodama trifosfatą 5’-gale iki difosfato;
Guanililtransferazė –
prie 5’-galo jungia GMP 5’-5’ ryšys);
7-metiltransferazė –
metilina galinio nukleotido (GMP) guanino heterociklinę bazę 7 padėtyje.
Kuom svarbi Cap1 modifikacija?
svarbi atskiriant “savą” iRNR nuo virusinės.
iRNR molekulių 3’-gale per brendimą prijungiama eilė
A nukleotidų.
Poli (A) (angl. polyA tail) sekos funkcijos:
• padidina iRNR molekulės stabilumą;
• užtikrina veiksmingą iRNR transliaciją;
• reikia iRNR išnašai iš branduolio į citozolį.
• poliadenilinimas yra tiesiogiai susijęs su RNR Pol II transkripcijos terminacija.
Poliadenilinimui reikia:
• cis sekų (pre-iRNR molekulės 3’ gale);
• trans veiksnių: ▪ šerdiniai veiksniai (skėlimo ir poliadenilinimo kompleksas); ▪ pagalbinių veiksnių (angl. auxiliary factors)
Šerdiniai polidenilinimo veiksniai:
• CPSF ir CstF jungiasi atitinkamai prie PAS ir G / U sričių;
• Skėlimo veiksniai CFI ir CFII.
Poli (A) polimerazė, PAP , būna
kelių izoformų.
Poliadenilinimo signalinė seka, PAS :
• labai konservatyvi;
• svarbi skėlimui ir poliadenilinimui (10 / 30 nt) nuo skėlimo vietos;
Ką užtikrina cis ir trans veiksniai?
splaisingo tikslumą ir veiksmingumą;
Splaisingo cis veiksniai:
• konservatyvios sritys intronuose ir egzonuose:
• 3’ splaisingo sritis;
• 5’ splaisingo sritis;
• šakojimosi taško seka (angl. branch point sequence);
• polipirimidinų ruožas;
• splaisingo stiprikliai ir slopikliai (angl. enhancers and silencers).
Splaisingo trans veiksniai:
• Splaisosoma;
• Splaisingo veiksniai:
▪ SR šeimos baltymai;
▪ heterologiniai branduolio baltymai, hnRNP.
Splaisingo chemija –
dvi trans esterinimo reakcijos:
Note
Flashcard